اندازه گیری لاکتوز شیر

روش های متفاوتی برای اندازه گیری لاکتوز شیر وجود دارد، روش لین آی نون یا فهلینگ، روشلورنس (با اسپکتروفوتومتری) و روش پلاریمتری که در این پست به آن اشاره می شود.

محلولات قندی یا ترکیبات دارای کربن نامتقارن می توانند نور پلاریزه را به راست یا چپ منحرف کنند که از روی میزان چرخش یا انحراف می توان غلظت ماده یا محلول قندی را مشخص کرد. به عبارت دیگر هر چه ماده در محلول بیشتر نور را منحرف کند غلظت آن بیشتر است.

برای دانلود گزارشکار بررسی وجود سالمونلا در تخم مرغ به ادامه مطلب مراجعه کنید.

محیط کشت Triple Sugar Iron Agar (TSI Agar)TSI:

-1هدف

تفكيك باسيل هاي روده اي گرم منفي ( بر اساس تخمير كربوهيدرات و توليد سولفيد هيدروژن )

2-اساس آزمايش

در اين محيط كشت، ساكاروز به دو قندی (دكستروز و لاكتوز) که در محیط كلايگلر آيرون آگار (KIA) وجود دارد، اضافه مي شود. افزودن ساكاروز، با تسهيل در جداسازي باسيل هاي تخمير كننده ساكاروز و نيز تخمير كننده هاي لاكتوز و يا دكستروز، حساسيت محيط را افزايش مي دهد. تخمير كربوهيدرات، با تغيير رنگ قابل مشاهده معرف pH يعني فنل رد (از قرمز به زرد) نشان داده مي شود. توليد سولفيد هيدروژن با ايجاد رسوبي كه محيط را در عمق لوله سياه مي كند و نتیجه افزودن سولفات فروس به محيط است، نشان داده مي شود.

براي تسهيل در جداسازي ارگانيسم هايي كه فقط دكستروز را تخمير مي كنند، غلظت دكستروز يك دهم
(0.1) غلظت لاكتوز يا ساكاروز است. مقدار كم اسيد توليد شده در سطح شيب دار لوله در طي تخمير دكستروز، به سرعت اكسيد مي شود و باعث مي شود محيط به pH قليايي( قرمز ) برگردد. در مقابل، بدلیل فشار پايين تر اكسيژن در عمق، واكنش اسيدي (زرد) حفظ مي شود.

توجه: به هنگام تهيه محيط كشت بايد دقت نمود كه طول سطح شيب دار و عمق محيط كشت در لوله، حدوداً 3 سانتي متر باشد.

محیط کشت (Sulfide-Indol-Motility) SIM:

با استفاده از این محیط سه خصوصیت مختلف باکتری را می توان سنجید و در تمام باکتری ها می توان بکار برد. به طریقه Stab تا یک سانتی متری انتهای لوله به وسیله آنس نوک تیز در این محیط کشت می دهیم.

اساس آزمایش:مواد اولیه تولید اندول یعنی اسید آمینه تریپتوفان در پپتونهای محیط موجود است. هیدروژن سولفوره و سولفات نیز در محیط موجود است.قوام نیمه جامد بودن محیط نیز اجازه پخش شدن و در نتیجه کدر نمودن محیط را به باکتری های متحرک می دهد.

ایجاد هیدروژن سولفوره توسط باکتری به صورت سیاه شدن محیط ظاهر می گردد و درصورت متحرک بودن باکتری کشت شده، سیاهی نیز تمام محیطی که باکتری پخش گردیده است ،انتشار می یابد .سیاه شدن محصول واکنش هیدروزن سولفوره تولید شده با سولفات آهن و تشکیل رسوب سولفوره آهن سیاه رنگ می باشد.با اضافه کردن یک میلی لیتر معرف کواکس Covacs و یک میلی لیتر کلروفرم به کشت 24 ساعته، ظهور رنگ ارغوانی در سطح کشت دلیل بر تولید ایندول توسط باکتری است .باکتریهای که حاوی مجموعه آنزیمهایی که اصطلاحا تریپتوفاناز نامیده می گردند ،باشند قادرند طی سری واکنشهای شیمیایی تریپتوفان را اکسیده و اندول استیک تولید نمایند.

حرکت باکتری بواسطه پخش شدن آن از مسیر خط کشت به اطراف و کدر نمودن محیط مشخص می گردد.باکتریهای فاقد حرکت تنها مسیر خط کشت را که نمایان است،کدر می کنند.برای تعیین تولید اندول می توان از محیط تریپتوز نیز استفاده نمود.

روش آماده سازی معرف کواکس جهت تست اندول :

فسفو دی متیل آمینو بنزآلدئید ------------------ 5 گرم

ایزو آمیل الکل ------------------- 75 میلی لیتر

اسید کلریدریک ------------------- 25 میلی لیتر

آلدئید را در الکل به آرامی حل نموده واز بنماری 55-50 درجه سانتیگراد استفاده نموده و به آن اسید اضافه رده و دور از نور و در 4 درجه سانتیگراد نگهداری می نماییم .رنگ معرف باید از زرد روشن تا قهوهای روشن باشد. بعضی از نمونه ها آمیل الکل کافی نیست و با آلدئید رنگ سیاه می دهد.

باکتری شناسی صنایع غذایی

كلستريديوم ها (Clostridium):

باسيل های گرم مثبت درشت و اسپوردار بي هوازي اجباري مي باشند. اسپور دراين جنس معمولا انتهايي يا نزديك به انتها مي باشد. اغلب متحرك و داراي فلاژلا ازنوع پري تريش مي باشند. همچنین تستهاي كاتالاز و اكسيداز در آنها نیز منفي بوده.

كلستريديوم بوتولينوم( C.botulinum):

عامل بوتوليسم (مسموميت غذايي شديد وكشنده) باسيل درشتي است كه اسپور آن بيضي شكل و نزديك به انتها قرار دارد. اين باكتري بي هوازي مطلق و متحرك است .

براي جداسازي باكتريهاي كه اسپوردارند ازروش جداسازي به كمك حرارت استفاده كرده و براي اين منظور بايد نمونه مورد آزمايش را درسرم فيزيولوژي سوسپانسيون شده و به مدت 10 دقيقه جوشانده شود تا ساير باكتريهاي بدون اسپور ازبين برود ( شوك حرارتي) سپس نمونه را درشرايط مناسب (بي هوازي براي كلستريديومها) كشت داده و كلنيهاي ارگانيسم را شناسايي كنيد.

براي شناسايي توكسين بوتوليسم ازتست الايزا و راديوايمونواسي و هماگلوتيناسيون پاسيو استفاده كرده.

و همچنین از محيطهاي انتخابي EYA (Egg-Yolkagar) و CBI C.botulinum Isolation براي ايزوله كردن كلستريديوم بوتولينوم استفاده مي شود.

كلسترديوم تتاني ( C. Tetani):

كلسترديوم تتاني يا باسيل نيكولاير عامل بيماري كزاز بوده که اين باكتري بي هوازي اجباري است و داراي اسپور انتهايي بزرگي است كه ظاهري شبيه چوب طبل براي باكتري ايجاد مي كند. اين باكتري متحرك و فلاژلا آن ازنوع پري تريش مي باشد.همچنین این باکتری قندها راتخمير نکرده وكاتالاز منفي است.

استريليزاسيون وسايل آزمايشگاهي

1.تمامي ظروف آزمايشگاه ميكروبي از قبيل پتري ديشها، پيپتها را در ظروف مخصوص خود قرار داده و محيط كشت ها تهيه شده مورد نياز را در داخل اتوكلاو قرار مي‌دهيم

2.اتوكلاو را روشن كرده و زمان آن را روي 20 دقيقه تا فشار 1Bar تنظيم مي كنيم تا مراحل استريليزاسيون انجام گردد و اتوماتيك وار بعد تمام شدن مراحل دستگاه خاموش مي شود . (فور 160 درجه سلسيوس(

 طرز تهيه محيط كشتها:

1.جهت تهيه محيط كشت ميزان مورد نياز ماده براي حل شدن در 1000cc آب مقطر نوشته شده كه اگر بخواهيم كمتر از اين مقدار تهيه كنيم با استفاده از تناسب ماده مي‌توان ميزان مورد نياز ماده جهت حل كردن در آب مقطر را تخمين زد. پس از تهيه محيط كشت ارلن را روي هيتر قرار مي‌دهيم تا كاملاً حل و شفاف شود سپس از روي هيتر برداشته و با پنبه و فويل درب محيط كشت را مي‌بنديم.

براي مثال :

پليت كانت آگار P.C.A : 1.20 گرم در 100 ميلي ليتر است كه اگر بخواهيم براي 50cc تهيه كنيم ، 50 را ضربدر 1.20 كرده وبر 1000 cc تقسيم مي كنيم وعدد بدست آمده را وزن كرده ودر بشر با آب مقطر به حجم 50 سي سي مي رسانيم سپس تا موقعي كه شفاف شود در روي هيتر نگه مي داريم ودر داخل بشر مگنت مي اندازيم تا مخلوط شود ودر هنگام جوشيدن كه كف هايي توليد كرد آنرا از روي هيتر برمي داريم .( آب مقطر را بايد قبلا به جوش برسانيم

در صورتيكه محيط كشت مصرفي SDA باشد به آن كلرامفتيكل (5/0 درصد) اضافه مي‌كنيم.

آفلاتوكسين ها

در سال 1959 يك واقعه منحصر به فرد به وقوع پيوست كه موجب جلب توجه محققين به بررسي مسئله مايكوتوكسين ها گرديد . اين مسئله موجب مرگ هزاران بوقلمون و ساير طيور در مزرعه اي در آنگلياي شرقي بود ، به دليل درگيري صنعت بوقلمون و صنعت توليد مكمل هاي غذايي طيور با اين مسئله تلاش هاي زيادي جهت شناسايي منشاء بروز اين شيوع گسترده بيماري (كه در ابتدا به عنوان بيماري نا مشخص بوقلمون ناميده شد) صورت گرفت . هر چند اين نام دلالت بر بيماريهاي نظير عفونت هاي ويروسي دارد ، اما نشان داده شد كه اين پرندگان توسط نوعي سم موجود در بادام زميني آسياب شده مورد استفاده در توليد مكمل پروتئيني خوراك طيور مسموم گرديده اند . اين ماده سمي كه بنام آفلاتوكسين (Aflatoxin)ناميده شد زير نور ماوراء بنفش داراي تلالو فلورسنس مي باشد و نشان داده شده كه به وسيله رشد كپك آسپرژيلوس فلاوس (Aspergillus flavus)بر روي بادام زميني توليد مي گردد . آفلاتوكسين نه تنها داراي سميت حادي مي باشد بلكه جزو سرطان زاترين تركيبات شناخته شده براي موش هاي صحرايي است . اثبات پتانسيل سرطانزايي آفلاتوكسين اين امكان را فراهم نمود كه منشاء بروز بيماريهاي نظير سرطان كبد در ماهي قزل آلاي رنگين كماني و هپاتيت در سگ ها كه تقريبا يك قرن پيش توصيف گرديده بود اما به عنوان يك مسئله ناشناخته باقيمانده بودند ، مشخص گردد . تكامل روش هاي آناليز بسيار دقيق جهت شناسايي آفلاتوكسين ها منجر به اثبات اين مسئله گرديد كه حضور اين تركيبات در برخي محصولات كشاورزي به ويژه بادام زميني و ذرت كه اغلب جهت مصرف انساني مورد استفاده قرار مي گيرند ، شايع مي باشد .

حضور آفلاتوكسين ها هنوز هم در انواع مختلف مواد غذايي و خوراك حيوانات گزارش مي گردد ، و هر چند غلظتهايي از آن كه موجب ايجاد علائم مسموميت حاد مي شود بر حسب ميلي گرم در كيلوگرم (mgkg-1) اندازه گيري مي گردد ، با اين حال امروزه روش هاي آناليز دقيق امكان اندازه گيري غلظت هاي آن در حد ميكروگرم در كيلوگرم (µgkg-1) را فراهم نموده اند .

اكنون مشخص شده است كه آفلاتوكسين ها به وسيله دو گونه كپكي يعني آسپرژيلوس فلاوس و آسپرژيلوس پارازيتيكوس (A.parasiticus) توليد مي گردند كه هر دو آنها به خصوص در مناطق گرمسيري و نيمه گرمسيري پراكنده هستند . اخيرا گونه سومي به نام آسپرژيلوس نوميوس (A.nomius)به عنوان مولد آفلاتوكسين شناسايي شده است اما گزارش هاي متعدد در منابع قديمي در رابطه با توليد آفلاتوكسين به وسيله ساير گونه ها ، حتي گونه هايي كه به جنس هاي مختلف ديگر تعلق دارند ، معمولا در نتيجه اشتباه يا ساخته و پرداخته ذهن بشر مي باشد .